Kronisk hoste
Brug af Tracheal Aspiration (TA), Bronchoalveolar Lavage (BAL) og biopsi til diagnosticering af luftvejsproblemer

Sanni Hansen DVM, Ph.d. studerende, Keith E. Baptiste, BVMS, Ph.d., Dip. ACVIM, Dip. ECEIM, Julie Fjeldborg, DVM, Ph.d., lektor, Institut for Produktionsdyr og Heste, KU, LIFE.

I klinisk praksis er hosteheste, særligt på denne årstid, en hyppigt forekommende patienttype. At diagnosticere heste med kronisk hoste eller Recurrent Airway Obstruction (RAO) kan være en stor udfordring. Til diagnosticering anvendes ofte TA, BAL og i mere avancerede tilfælde biopsi. Disse sammenholdes med klinisk fund og anamnese. Et dårligt opstaldningsmiljø prædisponerer for udviklingen af kronisk hoste, da lungernes anatomiske udformning gør, at støv og lignende ender i de caudodorsale lungeafsnit [1].

Tracheal Aspiration (TA)
En fordel ved TA er, at metoden kun kræver et kort endoskop (1 meter), hvilket findes på mange klinikker. I litteraturen anvendes forskellige volumener saltvand. På Universitetshospitalet for Store Husdyr anvendes som standard 30 ml NaCl. Saltvandet samles lige før indgangen til Apertura thoracis cranialis (figur 1). Den diagnostiske værdi af TA er meget omdiskuteret. Bakteriologisk findes en blandingsflora i trachea hos selv klinisk raske heste [2]. Cytologisk findes der også et meget varierende antal af neutrofile granulocytter hos raske heste. Nuværende viden tyder på, at den cytologiske værdi af TA er begrænset til et øjebliksbillede af opstaldningssituationen, ligesom flere studier ikke finder nogen korrelation mellem antallet af neutrofile granulocytter i BAL og antallet af neutrofile granulocytter i TA[3].

Bronchoalveolar Lavage (BAL)
BAL laves enten blindt med et specielt BAL kateter eller gennem et endoskop, der gerne er tre meter. Der er en række fordele ved at bruge endoskopet, idet det visuelt er muligt at vurdere larynx og graduere mængden af mucus i trachea. Ved den sidstnævnte metode udtages BAL-prøver direkte fra de caudodorsale lungeafsnit, og det er disse lungeafsnit, der ønskes undersøgt, når en hest præsenteres med en anamnese om kronisk hoste og/eller nedsat præstation.
Studier har vist, at diagnostisk gode prøver også kan fås med BAL udtaget blindt, da BAL katetre oftest ender i de caudodorsale lungeafsnit[4].

Målet med at udtage både TA og BAL er, at vurdere den procentvise fordeling af de forskellige inflammatoriske celler. Dette gøres ved at sende TA og BAL prøver til cytologisk vurdering i eget laboratorium eller et anbefalet laboratorium.

Protokol for TA og BAL:
1. Klinisk undersøgelse med fokus på respirationsorganerne
2. Sedation med Domosedan® 0,1ml/100kg hest og evt. Torbugesic®, der nedsætter hoste
3. Hesten sættes evt. i tvangsboks og det ene næsebor renses med fugtet gaze
4. Pharynx og larynx inspiceres for evt. anomalier.
5. Endoskopet føres videre ned gennem trachea, hvor mængden af mucus vurderes og gradueres fra 0-5 (tabel 1)[5]
6. Skarpheden af bifurcation trachealis inspiceres, og graden af ødem gradueres fra 0-4 [6]
7. TA: Endoskopet føres lidt tilbage, og 30ml. saltvand introduceres gennem endoskopets biopsikanal ilagt kateter, dead space tømmes, og straks herefter aspireres så meget væske som muligt
8. TA: Den aspirerede mængde pooles, og mængden noteres, hvorefter der overføres 5 ml. til et 10 ml. EDTA rør, der opbevares på køl indtil udførelse af cytologi.
9. BAL: Endoskopet/ BAL kateteret føres ned til de caudodorsale lungeafsnit, indtil der føles modstand, hvilket betyder at endoskopet/BAL kateteret har kilet sig fast i en 4-6 generationsbronkie.
10. BAL: 180 ml saltvand introduceres gennem endoskopets biopsikanal/BAL kateteret, dead space tømmes, og straks herefter aspireres så meget væske som muligt.
11. BAL: Den aspirerede mængde pooles, og mængden noteres, herefter overføres 5 ml. til et 10 ml. EDTA rør, der opbevares på køl indtil udførelse af cytologi.

Note: TA skal altid laves før BAL, hvis disse laves samtidig.

Protokol cytologi:
Totaltælling:
Udstyr til totaltælling: mikroskop, Bürker-Türk tællekammer og methylviolet eddikesyre.
1. EDTA-røret sættes i en blodvender i 5 min.
2. 50 µl EDTA-stabiliseret TA eller BAL væske tilsættes et rør med 950 µl methylviolet eddikesyre, og denne 1000 µl blanding sættes i blodvenderen i 5 min.
3. Et Bürker-Türk tællekammer monteres med dækglas, mens prøven vender.
4. Prøven fyldes i tællekammeret (10 µl overføres til kammeret i hver side, dobbeltbestemmelse)
5. Tællekammeret skal stå 2 min. før tælling.

(Tælletal (A))/(antal felter(B)xkammer dyb.(mm)(C)xfortynding1/20(D))

= celler pr µl

A. Leukocytter talt eks. 156 i de 2x4 lyse B felter.
B. Talt område: 4 hvide felter (= 4 x 1mm²) = 4mm²
C. Kammer dybde 0.1mm
D. Fortyndingsfaktor 1:20 (50 + 950 ml)

Differentialtælling:
Udstyr til differentialtælling: cytocentrifuge/ alm. centrifuge, pipetter og mikroskop.
1. EDTA-røret sættes i en blodvender i 5 min.
2. Cytospin-tragte og objektglas klargøres.
3. 50µl EDTA-stabiliseret TA eller BAL væske overføres til cytospin-tragten..
4. Cytospin-tragtene sættes i cytocentrifugen i 8 min. ved 13000rpm.
5. Objektglasset fjernes fra tragtene og lægges til tørring
6. Ved brug af alm. centrifuge centrifuges prøven, supernatanten hældes fra og cellepellet opslemmes. En dråbe af den opslemmede cellepellet overføres til objektglas, og der laves en udstrygning
7. Objektglasset fikseres i methanol og farves med May Gründwald Giemsa.
Farvning: May Gründwald Giemsa er den optimale farvemetode, da denne gør det muligt at differentiere mellem mastceller og makrofager. Hæmacolor® farvning kan også godt bruges, dog kan man ikke regne med antallet af mastceller.

Biopsi
Til yderligere evaluering af heste med nedre luftvejsproblemer vil det være muligt at tage lungebiopsier. Lungebiopsier kan vise graden af fibrose og peribronkal eosinofili, og kan yderligere være med til at understøtte den kliniske diagnose.
I nærværende Ph.d. projekt er et delmål, at vise om der er en sammenhæng mellem TA, BAL og biopsier. Et andet delmål er at sammenligne antallet af neutrofile granulocytter i BAL prøven med graden af fibrose i lungebiopsier hos heste med kronisk hoste.

Procedure for udtagelse af lungebiopsi
Biopsierne udtages percutant med en 14 G 15,2 cm manuel ”tru-cut” biopsi nål. Biopsierne udtages i hestens 11. intercostal rum, ca. 20 cm. dorsalt for skulderleddet. Området forberedes lege artis, hvorefter området infiltreres med lidokain subkutant og der laves en lille incision i huden lige cranialt for 12. ribben. Biopsinålen føres ca. 6 cm. ind i intercostalrummet, gennem pleura, hvor biopsien tages under inspiration. Biopsien fikseres i formalin og indstøbes i paraffin til efterfølgende histologi.
Biopsierne farves med Hæmatoxylin/eosin, Giemsa (specialfarvning for eosinofile) og masson’s trichrome (specialfarvning for fibrose)[8,9]. Histologi foretages i samarbejde med institut for Veterinær Sygdomsbiologi.

Referencer
1. Cunningham JG. Textbook of Veterinary Physiology 3 ed, 2002; 468-478
2. Döhl MGL, Undersøgelse af Cytologi og Bakteriologi i Tracheale Aspirater hos klinisk raske heste. 2011 Veterinært speciale.
3. Robinson NE, Kamaus W, Holcombe SJ, Carr EA & Derksen FJ. Airway inflammation in Michigan pleasure horses: prevalence and risk factors. Equine Veterinary Journal 2006; 38: 293-299.
4. McGorum BC, Dixon PM, Robinson NE & Schumacher J. Equine Respiratory Medicine and Surgery. 2007
5. Gerber V, Straub R, Marti E, Hauptman J, Herholz C, King M, Imhof A, Tahon L, Robinson N.E., Endoscopic scoring of mucus quantity and quality: observer and horse variance and relationship to inflammation, mucus viscoelasticity and volume. Equine Veterinary Journal 2004; 36: 576-582.
6. Koch C, Straub R, Ramseyer A, Widmer A, Robinson NE & Gerber V. Endoscopic scoring of the tracheal septum in horses and its clinical relevance for the evaluation of lower airway health in horses. Equine Veterinary Journal 2007; 39: 107-112.
7. Wasko AJ, Barkema HW, Nicol J, Fernandez N, Logie N, Léguillette R. Evaluation of a risk-screening questionnaire to detect equine lung inflammation: Results of a large field study. Equine Veterinary Journal 2010; 43: 145-152.
8. Venner M, Schmidbauer S, Drommer W & Deegen D. Percutaneous Lung Biopsy in the Horse: Comparison of Two Instruments and Repeated Biospy in Horses with Induced Acute Interstitiel Pneumopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine 2006; 20: 968-973.
9. Costa LR, Seahorn TL, Moore RM, Taylor HW, Gaunt SD & Beadle RE. Correlation of clinical score, intrapleural pressure, cytologic findings of bronchoalveolar fluid, and histopathologic lesions of pulmonary tissue in horses with summer pasture-associated obstructive pulmonary disease. American Journal of veterinary Research 2000; 61: 167-173.